RESUMEN

En el presente trabajo se estudiaron algunos cambios químicos y anatómicos que ocurren en las semillas de Enterolobium cyclocarpum Griseb., durante el proceso de hidratación. La semilla de esta especie presenta una testa dura que la hace impermeable al agua y posiblemente a los gases. El proceso de hidratación se puede acelerar tratando las semillas con un ácido fuerte o escarificándolas mecánicamente. Las semillas escarificadas mecánicamente mostraron un aumento en el peso fresco del embrión y una disminución en el peso seco de los cotiledones que iba acompañada de un incremento en el peso seco del eje embrional. Se observó una disminución del contenido de almidón de las células de los cotiledones la cual era seguida paralelamente por un aumento de los azúcares reductores; asimismo se encontró una disminución del nitrógeno total la cual era seguida por un aumento del contenido de nitrógeno soluble. El contenido de fósforo total de los cotiledones mostró una disminución gradual durante el proceso germinativo. Los cambios en el contenido de almidón se pudieron corroborar mediante estudios histológicos. Se observó que los cordones xilemáticos del eje embrional aparecían perfectamente diferenciados a las 72 horas de haberse iniciado la hidratación.

In the present work some anatomical and chemical changes were studied during the process of water uptake by Enterolobium cyclocarpum Griseb. seeds. The seed of this species is characterized by a hard coat that makes it impermeable to water and probably to gases. The imbibition process could by accelerated treating the seeds with strong sulphuric acid and by mechanical means. The seed under mechanical treatment showed an increase in the fresh weight of the embryo and a de crease in the dry weight of the cotyledons that was paralleled with an increment of the dry weight of the embrional axis. A decline of the starch content was observed in the cotyledons which were followed by an increase of reducing sugars. In so me way it was found that total nitrogen decreased but this was accompanied by an increase in the soluble nitrogen content. Total phosphorus content in the cotyledons decreased as germination proceeded. The changes in the starch content were confirmed with anatomical studies. It was observed that xylematic strands in the embryo axis appeared perfectly differentiated at about 72 hours after germination.

Una semilla se puede definir como un óvulo maduro y fecundado constituido por un embrión protegido por los tegumentos.⁸ La estructura fundamental de una semilla es el embrión vivo inmaduro que muestra algunas veces un alto grado de deshidratación.²⁰ Bajo esta forma, los tejidos son más resistentes a las condiciones desfavorables del medio ambiente, que los de una planta en estado activo de desarrollo y pueden sobrevivir así por largos espacios de tiempo. La semilla germina cuando se encuentra en un medio que le ofrece condiciones apropiadas de humedad, temperatura y aireación, iniciándose luego el crecimiento del embrión, la movilización de las reservas alimenticias y la emergencia de la radícula, que rompe las cubiertas seminales.^{5, 13} .

Es sorprendente que en un gran número de semillas, la latencia se debe a la presencia de una testa dura.⁴ La semilla de muchas leguminosas posee una testa dura impermeable al agua y a los gases, que constituye una barrera física que impide la germinación²¹.

La germinación de semillas en ciertas especies se puede inducir escarificándolas, removiéndoles la testa o colocando las semillas intactas en presencia de una alta concentración de oxígeno.²¹ Asimismo se ha observado que la cera epicuticular, la epidermis y el epimacio de las semillas de Podocarpus henkelii Stapf. constituyen una barrera física para la absorción de agua. 17

Las semillas de Pinus lambertiana Dougl., estratificadas a 5°C por 8 meses y llevadas a 20°C muestran buena germinación; pero si se eliminan las cubiertas seminales muestran una rápida germinación y no requieren ser estratificadas.³ Después de que la barrera de permeabilidad al agua y a los gases ha sido sobrepasada, se comienzan a operar una serie de cambios bioquímicos que traen como resultado la movilización de las reservas alimenticias contenidas en el endosperma o en los cotiledones.^7,10 En las semillas de algunas leguminosas, se ha observado que el contenido proteico de los cotiledones comienza a disminuir a partir del segundo día de la germinación.¹⁰ Las semillas de las leguminosas contienen también granos de almidón, los que se hidrolizan y aparecen arrugados en su superficie al ser observados al microscopio.²

En el presente trabajo se estudiarán las posibles causas de la latencia de la semilla de Enterolobium cyclocarpum Griseb. (cara-caro), perteneciente a la familia Leguminosae, así como los cambios anatómicos y en las sustancias de reserva que se operan durante su proceso de hidratación.

Las semillas del Enterolobium cyclocarpum Griseb. utilizadas para realizar este trabajo fueron suministradas por el Instituto de Silvicultura de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Los Andes. El peso fresco inicial de una semilla varió entre 0.715 y 0.756 gm Y mostró un contenido de humedad promedio de 9.4% .

1. Estudios Anatómicos

 

Para realizar el corte de la testa se sometió la semilla a un tratamiento de ablandamiento en agua destilada hirviendo por 15 minutos, luego se realizó un corte transversal de la testa en el micrótomo de Minot a un espesor de 15 µm. El corte así obtenido se montó en una lámina porta-objeto y se le añadió una gota de xilol y luego una gota de resina sintética harleco (Arthur H. Thomas Co.), se observó al microscopio y se le hizo un registro fotográfico.

Los cambios operados en los cotiledones y eje embrional durante el proceso de hidratación de la semilla, se estudiaron tomando muestras de los cotiledones y ejes embrionales cada
24 horas, se fijaron en F.A.A. que es una mezcla de 10 ml de formaldehído al 35%: 5 ml ácido acético glacial al 99.7% : 50 ml de alcohol etílico al 95 % y 35 ml de agua destilada, luego se deshidrataron los tejidos en una serie de alcohol etílico - alcohol butílico normal y se infiltraron por 72 horas en parafina con punto de fusión entre 51-53°C, se prepararon bloques de parafina con el material respectivo y se hicieron cortes transversales en un micrótomo de Minot entre 10-15 µm. Las secciones fueron teñidas luego con safranina y fast-green. Las observaciones y registros fotográficos se hicieron en un microscopio Leitz Orthoplan con cámara Orthomat.

 

2. Hidratación

Para investigar el efecto de la escarificación mecánica y química sobre la hidratación de las semillas, se procedió a esterilizar superficialmente tres lotes de la semillas cada uno con hipoclorito de sodio al 5.25 % por 5 minutos, luego se lavaron. con agua destilada estéril y se pusieron sobre un papel de filtro en cajas de petri, a las que se le agregaron 20 ml de agua destilada estéril. Las semillas se colocaron a germinar en la oscuridad a una temperatura entre 20-25°C; los incrementos en peso debido a la hidratación fueron registrados gravimétricamente utilizando una balanza analítica marca Sartorius.

La escarificación química se realizó colocando tres lotes de 10 semillas cada uno en H₂S0₄ concentrado de densidad 1.84 g/cm³ por una hora; luego se lavaron las semillas con agua destilada estéril hasta pH neutro y se registró su peso inicial. Estas semillas se pusieron a hidratar en placas de petri como se describió anteriormente.

Para la escarificación mecánica se procedió a limar la región micropilar y la parte opuesta a la misma, las semillas fueron lavadas con agua destilada y se pusieron a hidratar de la manera indicada.

 

3. Cotiledones y ejes embrionales

 

Se estudió también el proceso de hidratación de los cotiledones y ejes embrionales de semillas escarificadas mecánicamente, las que eran tratadas como se mencionó arriba. Los pesos frescos se registraron gravimétricamente a intervalos de 24 horas; los pesos secos se determinaron después de secar los tejidos en una estufa a 80°C. Después de secos, los tejidos se pulverizaron en una licuadora y se procedió a pesar las alícuotas correspondientes para los análisis de nitrógeno, fósforo, azúcares reductores y almidón.

4. Preparación del extracto soluble en alcohol al 70%

 

Se pesaron 100 mg de tejido pulverizado, que se lavó tres veces con alcohol al 70% ; luego se tomó una alícuota de 10 ml del extracto alcohólico y se evaporó hasta sequedad a 65°C, se completó el volumen a 50 ml con agua destilada y se usaron alícuotas de 3 ml para la determinación de los azúcares reductores utilizando el reactivo de Somogy y de Arsenomolibdato.¹ La variación de la densidad óptica se midió a 540 nm; las concentraciones de azúcares reductores se determinaron comparando las muestras con una solución patrón de glucosa.

El nitrógeno soluble se determinó en el residuo dejado al evaporar 10 ml de solución alcohólica a 65°C, usando el método de Microkjeldahl. ¹⁷

5. Almidón

El contenido de almidón de los cotiledones se determinó en el residuo dejado después de la extracción alcohólica.⁹

6. Nitrógeno total

 

El contenido de nitrógeno total se determinó por Microkjeldahl, en 100 mg de muestra pulverizada y digerida.

 

7. Fósforo total

 

El fósforo total se determinó digiriendo 100 mg de tejido pulverizado con 10 ml de HN0₃ concentrado y luego con una mezcla de H₂S0₄: HClO₄ (1:1), se completó a un volumen determinado, se tomó una alícuota de 2 ml, se ajustó el pH entre 3-4 usando como indicador dinitrofenol 10^-3M, se hizo reaccionar la muestra con el re activo de molibdato y se midió el color azul a 660 nm en un espectrofotómetro Spectronic 20.¹¹

 

En la Fig. 1 se puede observar un corte transversal de la testa, en la que se distingue claramente una epidermis externa c y c', llamada también capa en empalizada, que se caracteriza por estar compuesta de macroesclereidas o células de Malphigio. La capa más externa (a), es la cutícula que se encuentra por encima de una subcutícula (b) que recubre una capa de macroesclereidas (c). Entre las células de la capa en empalizada (c) y (e'), se observa una línea clara (d), característica de la capa en empalizada de las leguminosas. Luego encontramos la capa subepidérmica (e) con células parecidas a un reloj de arena. El tejido más profundo es el parénquima (f), que puede tener grandes espacios intercelulares; esta capa presenta una pigmentación marrón que le da la coloración propia a la semilla. Por último, limitando a los cotiledones se encuentra una epidermis interna, que no se observa en esta figura.

En la Fig. 2 se puede observar el corte transversal de un cotiledón en el que se distinguen células de granos de almidón, que es la sustancia de reserva principal de esta semilla.

Fig.1. Corte transversal de la cubierta seminal del Enterolobium cyclocarpum, en la que se distingue claramente la cutícula (a), una subcutícula (b), la capa en empalizada (c) y (c'), la lÍnea clara (d), la capa subepidérmica (e) y por último la zona parenquimática (f).	Fig. 2. Corte transversal de un cotiledón a las 48 horas de hidratación, mostrando células paranquimáticas repletas de granos de almidón.

Los granos de almidón también constituyen la sustancia de reserva más importante del eje embrional, como se puede ver en la Fig. 3.

En la Fig. 4 se observa el corte transversal a nivel del hipocótilo de un eje embrional a las 96 horas de hidratación; aquí ya vemos que el almidón de reserva ha desaparecido de las células y que el cambium vascular origina vasos xilemáticos que pueden distinguirse muy bien por sus gruesas paredes celulares lignificadas. Bajo las condiciones en que se realizó este trabajo la diferenciación de conductos xilemáticos se comenzó a observar a las 72 horas de hidratación de las semillas.

Fig. 3. Corte transversal del eje embrional a nivel del hipocótilo después de 24 horas de hidratación, en el que se observan cordones meristemáticos, y células parenquimáticas llenas de almidón.	Fig. 4. Corte transversal de un eje embrional después de 96 horas de hidratación. Se puede observar el xilema bien diferenciado y la ausencia de almidón en las células parenquimáticas.

En la Fig. 5 se puede observar el efecto de la escarificación química y mecánica sobre el curso de la hidratación de las semillas de Enterolobium cyclocarpum. La absorción de agua por las semillas sin escarificar, es muy lenta y se estabiliza en menos de 30 horas de haberse iniciado este proceso, alcanzando un 14 % de incremento en peso durante este período. Se puede notar que este proceso está por debajo del potencial de hidratación y también por debajo del contenido de agua requerido para que se produzca la germinación.

La escarificación química da como resultado una mayor absorción de agua por las semillas, pero hay una fase de hidratación lenta que dura aproximadamente unas 30 horas, que es seguida de una fase de absorción rápida que tiende a estabilizarse después de 72 horas, alcanzándose un 120% del peso inicial al final de la misma. La escarificación mecánica no presenta la fase lenta de absorción de agua que presenta la escarificación química, sino que es mucho más rápida y se estabiliza a 96 % del peso inicial. En las semillas escarificadas mecánicamente, la radícula emergía en 72 horas, mientras que en las semillas escarificadas químicamente lo hacía en 120 horas.

Fig. 5. imbibición en agua de semillas de Enterolobium cyclocarpum, sometidas a diferentes tratamientos de escarificación.	Fig. 6. Incremento de peso fresco de los cotiledones y ejes embrionales, de semillas escarificadas mecánicamente colocadas en agua

La ausencia de la fase lenta de hidratación en las semillas escarificadas mecánicamente permitió seleccionar este método para realizar el resto de las experiencias reportadas en el presente trabajo.

La Fig. 6 muestra el incremento en peso fresco de los cotiledones y ejes, cuando se escarifican las semillas mecánicamente. Se observa que no se presenta la fase lenta de hidratación observada en la escarificación química, ya que el proceso de hidratación es casi lineal. Durante el proceso de hidratación se siguieron las variaciones en el peso fresco de cotiledones y ejes embrionales, como se observa en la Fig. 7. El peso fresco de los ejes embrionales aumenta desde el mismo momento en que se inicia el proceso de hidratación; al mismo tiempo los cotiledones también aumentan en peso fresco, aumento que se prolonga por 144 horas. A las 168 horas el peso comienza a disminuir y a las 192 horas ha disminuido 5.1 % del peso máximo alcanzado.

Al expresar los resultados en base al peso seco (Fig. 8) se puede observar que en las primeras 48 horas, el peso de los cotiledones aumenta y que a las 72 horas comienza a disminuir, habiendo disminuido en 192 horas el 28.1 % del peso seco inicial. Los ejes embrionales presentan un aumento gradual en peso seco desde el momento en que se inicia la hidratación del embrión, presentando un aumento de 165.3 % del peso seco inicial a las 192 horas.

Fig. 7. Variación en los pesos frescos de cotiledones y ejes, durante el proceso de hidratación de semillas escarificadas mecánicamente	Fig.8 Variaciones en los pesos secos de cotiledones y ejes embrionales durante el proceso de hidratación de semillas escarificadas mecánicamente

El contenido inicial del almidón de los cotiledones de Enterolobium cyclocarpum Griseb. es de 22.2% como se puede observar en la Fig. 9; a medida que se hidrata la semilla comienza a disminuir lentamente el contenido de este polisacárido, declinando más rápidamente después de 52 horas de inbibición; después de 144 horas de hidratación, la disminución se hace gradual. Al mismo tiempo que comienza a disminuir el contenido de almidón, se observa un aumento,en el contenido de azúcares reductores (Fig. 9), el cual disminuye rápidamente después de 72 horas de hidratación.

El nitrógeno total de los cotiledones disminuye gradualmente desde el comienzo del período de hidratación, como se puede 0bservar en la Fig. 10; al mismo tiempo la concentración de nitrógeno en el extracto alcohólico de los cotiledones aumenta, alcanzando su mayor valor a las 144 horas de iniciado el proceso de hidratación; a partir de ese momento continúa disminuyendo gradualmente.

La concentración de fósforo en los cotiledones disminuye lentamente con el período de hidratación (Fig. 10).

Fig.9 Cambios en el contenido de almidón y % de azúcares reductores (o-o) de los cotiledones de Enterolobium cyclocarpum durante la germinación de las semillas escarificadas mecánicamente.	Fig.10 Cambios en el contenido de nitrógeno total, nitrógeno soluble y % fósforo de los cotiledones durante la germinación de las semillas escarificadas mecánicamente.

Los resultados obtenidos en este trabajo, indican que el retardo en la germinación de las semillas de Enterolobium cyclocarpum Griseb., está determinado por la dureza de la testa. La estructura anatómica de la testa posee una capa compacta de esclereidas en empalizada, a la que algunos autores⁴ le han atribuido la causa de la impermeabilidad de las cubiertas seminales. La línea clara observada en la epidermis de la semilla de Enterolobium, podría muy bien constituir una barrera para la difusión de gases y agua, dificultando así la germinación. La pared celular en la región de la línea clara es muy compacta y podría ser la causante de la impermeabilidad de la testa.⁶

La impermeabilidad de la testa del Enterolobium cyclocarpum se pone de manifiesto cuando se realizan los ensayos de inbibición, observándose que al alterar la estructura de la testa la hidratación de las semillas procede rápidamente. Esta barrera para la absorción de agua, no solamente ha sido observada en las semillas de las leguminosas,⁴ sino también en las semillas de Podocarpus henkelii, en las que la eliminación de la cera epicuticular, la epidermis y el epimacio acelera la hidratación.¹⁷ En Pinus lambertiana Dougl., se ha encontrado también que la remoción de las cubiertas seminales da lugar a una germinación rápida.³

Durante la germinación de las semillas del Enterolobium cyclocarpum, se encontró un aumento del peso fresco del embrión, lo que se podría deber a un incremento de las sustancias osmóticamente activas, producidas como resultante de la hidrólisis del almidón y de las proteínas de reserva, produciéndose de esta manera una disminución del potencial hídrico con una consecuente movilización de agua hacia los tejidos de la semilla. Esto se puede inferir de los resultados obtenidos, ya que al mismo tiempo que disminuyen el nitrógeno total y el almidón aumentan los azúcares reductores y el nitrógeno soluble.

Si analizamos los resultados en base al peso seco, vemos que al perder peso los cotiledones, lo ganan los ejes embrionales; esto se puede deber a una movilización de las reservas de los cotiledones hacia el eje embrional. Los estudios anatómicos también confirman esta hipótesis, ya que se puede observar la desaparición del almidón de los cotiledones durante el proceso de hidratación.

La movilización de las reservas del embrión se pueden deber a un aumento de la actividad de enzimas amilolíticas y proteolíticas, como ha sido observado en el endosperma de cereales después de la germinación de la plántula^12,15,18 Y también durante la germinación de Phaseolus aureus Roxb.^7,10

La disminución del fósforo total de los cotiledones de Enterolobium cyclocarpum puede deberse a su movilización hacia el eje embrional durante la germinación, para ser usado luego en la síntesis de AIP, el cual se forma rápidamente durante el período de hidratación.¹⁴

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Revisado: 16 de Abril de 2008 .